Das übergreifende Ziel eines jeden Bioprozessingenieurs ist es, physiologische Veränderungen in Biopharmazeutika durch die Kontrolle des Produktionsprozesses zu minimieren. Biopharmaunternehmen setzen häufig eine Vielzahl von cGMP-Verfahren ein, um die molekulare Stabilität während der gesamten Produktverarbeitung zu überwachen. Die Kryokonservierung kann die Haltbarkeit eines Arzneimittels während der Lagerung verlängern, manchmal sogar auf unbestimmte Zeit. Die weitere Wirksamkeit hängt jedoch davon ab, wie die Produkte eingefroren und aufgetaut werden.

Risiken für biopharmazeutische Produktqualitätsmerkmale (PQA) beim Einfrieren und Auftauen

Die biologischen Wissenschaften an der Spitze der Biowissenschaften, der Biopharma- und der Biotech-Industrie beruhen häufig auf den physikalischen Eigenschaften der Zellbiologie, wobei die Rekristallisationstemperatur von Wasser bei -120 °C eine entscheidende Größe ist. Hier hängt die Lebensfähigkeit einer Säugetierzelle davon ab, ob die Integrität der Zellwand während der Verarbeitung, des Herunterfahrens auf Temperatur, der Langzeitlagerung und des Auftauens erhalten bleibt.

Eine ordnungsgemäße Zellvorbereitung ist für die Lebensfähigkeit in allen Phasen des Prozesses entscheidend. Suspensionsmittel wie Glycerin oder Dimethylsulfoxid (DMSO) werden verwendet, um die Bildung mikroskopisch kleiner Eiskristalle zu verhindern, entweder außerhalb oder innerhalb der Zelle. Die Bildung solcher Kristalle kann die Zellwand beeinträchtigen und zur Zelllyse führen, wodurch die Zelle oder das Produkt, das die Zelle produzieren soll, zerstört wird.

Unkontrolliertes Einfrieren von biopharmazeutischen Arzneimitteln und Therapeutika

Arzneimittel oder Arzneimittelwirkstoffe werden in der Regel entweder in einem kontrollierten Gefrierverfahren oder in einem unkontrollierten Gefrierverfahren gelagert und aufgetaut. Um sicherzustellen, dass der Produktabbau gestoppt wird, damit die Haltbarkeit bei langfristiger Lagerung angemessen verlängert wird, und um eine Destabilisierung der Moleküle des Arzneimittels zu verhindern, müssen die Proben die Glasübergangstemperatur (Tg′) des Proteins durch eine kontrollierte Abkühlungsrate erreichen^.1

Selbst bei Standardverfahren oder eingeschränkten Kontrollen führt das unkontrollierte Einfrieren und Auftauen von Arzneimitteln zu Ergebnissen, die nicht skalierbar oder reproduzierbar sind. Unkontrolliertes Einfrieren kann auch Stressfaktoren wie pH-Verschiebungen und Kältedenaturierung verursachen, die sich auf die PQA von Biopharmazeutika auswirken. Nur durch kontrolliertes, langsames Einfrieren und allmähliches Auftauen von biopharmazeutischen Arzneimitteln und Therapeutika können konsistente, optimierte Ergebnisse gewährleistet werden.

Aufrechterhaltung der Probenintegrität durch kontrolliertes Einfrieren und Auftauen

Die Zelle selbst steht im Mittelpunkt der meisten biowissenschaftlichen Forschungen und Entwicklungen, die auf Säugetierzellkulturen basieren. Während die biologischen Eigenschaften der Zelle, ob künstlich hergestellt oder natürlich, endemisch sind, ist die Zelle das Vehikel, auf das sich alle Aktivitäten konzentrieren. Wenn der Schwerpunkt der pharmazeutischen Produktion auf der Zellebene liegt, bleibt die Notwendigkeit, die molekulare Stabilität in allen Produktionsphasen zu schützen, ein gemeinsamer Nenner, um die Integrität, Lebensfähigkeit und Wirksamkeit des Arzneimittels zu gewährleisten. Die Geschwindigkeit, mit der biopharmazeutische Produkte eingefroren werden, die Temperatur, auf die sie zunächst heruntergekühlt werden, die Verweilzeit, die erforderlich ist, um die Ladung gründlich einzuweichen, und die Freigabe auf die endgültige Lagertemperatur sind Funktionen, die nur mit einem Umluftsystem erreicht werden können. Wenn cGMP-Kriterien auferlegt werden und die Einhaltung der FDA 21 CFR-Vorschriften für Pharmazeutika oder die Qualität von Arzneimitteln vorgeschrieben ist, sind Leistung und Dokumentation von entscheidender Bedeutung, um die Einziehzeit und die Temperaturgleichmäßigkeit von Geräten mit extrem niedrigen Temperaturen zu überprüfen. Die Wahl eines Tiefkühlgeräts mit aktiver Steuerung als Teil des gesamten Produktionsprozesses unterscheidet den Prozess von konventionellen Tiefkühlkonzepten.

Da pharmazeutische Produkte in großen Mengen transportiert werden, ist ein ausgewogenes Verhältnis zwischen Schrankgröße und -design, Kühlleistung, BTU-Entnahmekapazität, Bestandsbeladung sowie Leistungsverfolgung und -aufzeichnung in allen Phasen erforderlich.

Ausrüstungsüberlegungen für den Abzug und die Lagerung von Biopharmaprodukten

Nicht alle Ultratiefkühlgeräte können die für das Einfrieren und Auftauen biopharmazeutischer Produkte erforderlichen Bedingungen sicher gewährleisten. Unabhängig von der beabsichtigten Temperatur gehört zu einem grundlegenden Verständnis der Kategorien von Ultratiefkühlgeräten die Kenntnis des Unterschieds zwischen Lager- und Prozessgefriergeräten, Kaltwand- und Zwangsluftkühlung, stationärem und Prozessbetrieb sowie der Wärmeabfuhrkapazität und ihrer Auswirkungen auf zelluläre Mechanismen. Die Wissenschaft der biologischen Konservierung ist zwar sehr umfangreich und umfasst verschiedene Varianten, je nachdem, was eingefroren wird, zu welchem Zweck und wie lange, doch die Notwendigkeit, ein biologisches Produkt einzufrieren, zu lagern, aufzutauen und zu transportieren, ist für die Biopharmaindustrie von zentraler Bedeutung.

Die meisten Ultratiefkühltruhen, die für die routinemäßige Lagerung und Langzeitkonservierung verwendet werden, sind als Kaltwandtruhen mit passiver Temperaturregelung konzipiert. Kalte Luft umgibt das Gefriergut, das auf natürliche Weise ohne zusätzliche Luftzirkulation einen stabilen Zustand bei dem gewünschten Sollwert, in der Regel -80 °C, erreicht. Einmal eingefrorene Zellen können unter diesen Bedingungen unbegrenzt gelagert werden, obwohl man die Auswirkungen des Einfriervorgangs erst nach Monaten oder Jahren feststellen kann, wenn die Zellen aufgetaut sind. Während herkömmliche Ultratiefkühlgeräte gut für die Fertigstellung gefrorener Arzneimittelprodukte geeignet sind, kann nur ein Gefriergerät mit Zwangsbelüftung, das für das Einfrieren mit hohem Durchsatz ausgelegt ist, die Ungewissheit beseitigen, ob eine Produktladung nach einem genehmigten Pulldown vollständig bei der richtigen Temperatur gefroren ist.

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Gebläsekonvektionstechnologie

Auch wenn passive Kältespeicher ihren Platz in der Gesamtgleichung haben, bleibt die Notwendigkeit des kontrollierten Einfrierens eine Überlegung, wie man biopharmazeutische Arzneimittelprodukte überhaupt erst auf den Sollwert bringen kann. In diesem Fall bietet ein Gefriergerät mit Zwangsbelüftung, das oft auch als Gebläsegefriergerät bezeichnet wird, eine aktive Steuerung der Abkühl- und Eintauchtemperatur, die Freigabe auf eine wärmere Lagertemperatur und die Möglichkeit, bei Bedarf ein kontrolliertes Auftauen einzuleiten. Entscheidend für diesen Prozess ist die Regelgenauigkeit, die in der Regel in Grad pro Minute angegeben wird, die Temperaturgenauigkeit auf ein Grad genau und die Temperaturgleichmäßigkeit im gesamten gelagerten Produkt. Ohne eine enge Temperaturgleichmäßigkeit können die Erwartungen an die Reproduzierbarkeit und die optimale PQA eines Arzneimittels nicht erfüllt werden.

Trotz der Biochemie und Physik der Biopharmaproduktion ist die Temperaturkontrolle während des gesamten Prozesses absolut notwendig, von der Produktion über die Lagerung bis hin zum Schutz der Kühlkette. Dies wurde während der COVID-19-Pandemie eindrucksvoll bewiesen, als Pharmaunternehmen mit den Herausforderungen des Transports und der Lagerung auf der letzten Meile konfrontiert wurden, die durch die Anforderungen an die Lagerung von mRNA-Impfstoffen bei extrem niedrigen Temperaturen entstanden. Wenn die Transportbedingungen nicht dokumentiert werden konnten, wurden Impfstoffchargen zurückgewiesen, da ihre Wirksamkeit nicht mehr gewährleistet werden konnte.

Der Einsatz von Ultratiefkühlern in der Biopharma-Produktion ist eine Konvergenz von Kältetechnik, Chemie und Physik gemischter Kältemittel, der Wissenschaft der Zellbiologie, der Produktions- und Lagerlogistik und einer integrierten Qualitätssicherung, die eine lückenlose Dokumentation bietet. Anekdotische Hinweise deuten darauf hin, dass pharmazeutische Produkte, die für die Lagerung eingefroren werden, nicht immer durchgehend gefroren sind. Um die Einhaltung der Zieltemperatur zu gewährleisten, bedarf es mehr als nur des äußeren Anscheins. Aus diesem Grund kann ein Gefrierschrank mit Zwangsbelüftung so programmiert werden, dass er ein Produkt mit einer kontrollierten Rate ab Umgebungstemperatur einfriert. Auf diese Weise können Bioprozessingenieure die Gefrierfunktion bis zur angestrebten Lagertemperatur fortsetzen und die Produktladung bei einer tieferen Temperaturverweilzeit halten, um das Schüttgut bei einer Verweilzeit unterhalb der angestrebten Langzeitlagerung gründlich zu durchtränken. Sobald die Verweilzeit beendet ist, kann die Ladung auf eine wärmere Lagertemperatur, typischerweise -80°C, gebracht werden.

Sobald die pharmazeutischen Produkte ordnungsgemäß eingefroren sind, können sie zur Bestandslagerung vor dem Versand in begehbare Räume gebracht werden. Hier ist die Funktion des Gefrierschranks die Instandhaltung und nicht ein Abziehvorgang. Begehbare Räume sollten nur für die Lagerung und nicht für die Entnahme verwendet werden. Im Gegensatz zu Gefrierschränken für die Lagerung, einschließlich begehbarer Räume, sind Gefrierschränke mit Zwangsbelüftung für den Zellschutz leistungsorientiert, was bedeutet, dass die Arbeit schnell und mit dem Hauptaugenmerk auf Qualität erledigt werden muss. Da Tiefkühltruhen mit Zwangsbelüftung schneller und mit besserer Kontrolle über den Pulldown-Prozess kühlen können, sind sie eine wesentliche Komponente im Produktionsprozess.

Die meisten pharmazeutischen Verfahren sind zwar nach wie vor urheberrechtlich geschützt, aber zusätzliches Material zum kontrollierten Einfrieren und Auftauen ist bei Branchenorganisationen wie der International Society for Biological and Environmental Repositories (ISBER) und Herstellern wie FARRAR™, powered by Trane Technologies, erhältlich.

Die speziell für Bioprozessanwendungen konzipierte Kammer der Serie 4000 mit kontrollierter Geschwindigkeit bietet Gleichmäßigkeit und Wiederholbarkeit bei schnellen, kontrollierten Einfrier- und Auftauanwendungen. Die einzigartige Konvektionskühlung mit Zwangsluft reduziert die Gefrier-/Auftauzeiten von +40°C bis -80°C von Tagen oder Wochen auf Stunden. Programmierbare Gefrier-/Auftauprofile und die universelle Akzeptanz von Behältern bedeuten, dass eine Gefrier-/Auftauprozesskammer die Anforderungen mehrerer Arzneimittel und Wirkstoffe erfüllt.

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Fußnoten

1. William J. Rayfield, Sunitha Kandula, Heera Khan, Nihal Tugcu, "Impact of Freeze/Thaw Process on Drug Substance Storage of Therapeutics", Journal of Pharmaceutical Sciences, Band 106, Ausgabe 8, 2017, Seiten 1944-1951, https://doi.org/10.1016/j.xphs.2017.03.019.
2. Nikola Radmanovic, Tim Serno, Susanne Joerg, Oliver Germershaus, "Understanding the Freezing of Biopharmaceuticals: First-Principle Modeling of the Process and Evaluation of Its Effect on Product Quality", Journal of Pharmaceutical Sciences, Band 102, Ausgabe 8, 2013, Seiten 2495-2507, https://doi.org/10.1002/jps.23642.